液相日常應(yīng)用三要素之——樣品

本文轉(zhuǎn)自：藥品質(zhì)量研究本文轉(zhuǎn)載自“藥品質(zhì)量研究”公眾號，作者：Yvette-葉

樣品、固定相（色譜柱）和流動相作為液相日常分析的三要素，與我們建立科學(xué)穩(wěn)健的分析方法息息相關(guān)。日常遇到的各種分析問題，除硬件外，無外乎這三者。

從方法開發(fā)角度來說，從頭設(shè)計，過程中解決好這三者之間的關(guān)系，一般都能設(shè)計一套適合的方法；從重復(fù)（藥典）方法來說，理解好各個要素的影響，就能解決好過程中無法重現(xiàn)的問題。今天，我們就來談?wù)勔合嗳粘?yīng)用三要素之一樣品。

1、樣品組成的考慮

比如，對于以下結(jié)構(gòu)：

極性小的組合：確保各組分能全部洗脫；

極性差異非常大的組合，綜合考慮，折中取舍，可選擇多套方法以同時滿足要求；

各化合物解離的程度與疏水保留的關(guān)系如下曲線所示：

上圖中，紅色方框中為穩(wěn)定保留區(qū)域，pKa附近，微小的pH變化都能導(dǎo)致保留時間較大的差異，對于中性化合物來說，在整個pH范圍區(qū)間內(nèi)保留均較穩(wěn)定。

2、樣品濃度的選擇

我們知道，對于一個藥品的雜質(zhì)譜，其各個雜質(zhì)的限度是有差異的，根據(jù)ICH或者藥典標(biāo)準(zhǔn)，各已知雜質(zhì)均有各自對應(yīng)的限度。又因為各個雜質(zhì)在確定的分析方法下響應(yīng)不一致，故其定量限也是不一樣的。能否對每一個雜質(zhì)都能準(zhǔn)確定量，取決于響應(yīng)低的雜質(zhì)是否滿足定量要求。若樣品濃度過低，在有關(guān)物質(zhì)（雜質(zhì)）檢測中會導(dǎo)致靈敏度不夠，無法滿足定量限低于報告限的要求。

若濃度選擇過高，對于主成分含量的測試，則導(dǎo)致方法學(xué)驗證中含量不呈線性；對于有關(guān)物質(zhì)來說，特別是主峰后的一些雜質(zhì)，會因為主成分拖尾而導(dǎo)致準(zhǔn)確度無法滿足要求；另外，一般情況下，會用流動相來進(jìn)行稀釋，若主成分濃度太高，則會改變供試品的溶液環(huán)境，使其中帶檢測的某一組分出峰與其對照品有差異。

3、樣品稀釋劑的選擇

說到樣品的稀釋劑，這是咱們分析人員常碰到的問題，也是熟悉的問題。但凡做分析的小伙伴，都能對溶劑效應(yīng)道出個123來。

對于溶劑效應(yīng)，小伙伴們的di一反應(yīng)肯定是在反相色譜分析過程中，由于用純乙腈/純甲醇等高比例有機相溶解樣品，然后在進(jìn)樣后發(fā)現(xiàn)色譜圖中處于前面的峰發(fā)生裂峰的問題。這是由于供試品中的溶劑強度高于流動相的關(guān)系。解決方式除了可以換稀釋劑外，還可以嘗試減少進(jìn)樣量來進(jìn)行改善。

另一種溶劑效應(yīng)是由于樣品的加入，導(dǎo)致供試品的pH和流動相的pH差異較大，導(dǎo)致流動相無法在短時間內(nèi)讓進(jìn)樣的供試品達(dá)到平衡而導(dǎo)致出峰異常，包括峰形異常和出峰時間與對照品有差異。

稀釋劑的選擇還可能會造成鹽析。特別是對于一些從原料藥方法衍生而來的針對制劑的檢測方法。由于制劑中輔料成分相對更加復(fù)雜，某些原料藥使用的稀釋劑可能會讓制劑供試品產(chǎn)生鹽析，導(dǎo)致出峰異常或者影響組分的回收率，影響檢測的重現(xiàn)性，甚至導(dǎo)致色譜柱及儀器堵塞。

后一種情況則是由于溶出等特殊情況，導(dǎo)致供試品溶液中有其他成分，如SDS等，干擾測試，導(dǎo)致出峰異常；或者是由于溶出液pH不一致，導(dǎo)致的出峰異常，這個情況與前述的pH不一致歸因一致。

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