不管你的極性有多強！我都會牢牢抓住你

反相色譜柱一般是由硅膠，有機/無機雜化硅膠或者聚合物作為基質， C18作為鍵合相。典型反相色譜柱基于分析物與烷烴鏈之間的疏水相互作用，根據樣品組分的極性大小的差異而實現樣品組分的分離。該分離模式有賴于色譜柱多孔基質內的C18鍵合相的自由伸展構象。

對于有機酸/堿類化合物，多羥基化合物以及偶氮類等極性化合物，由于含有羧基，氨基，羥基等可解離部分，其極性較大而不適合以經典反相C18類鍵合相進行分離。其典型表現為容量因子K過小，導致該類化合物在死時間附近出峰。

對于這些極性化合物，雖然我們可以在做梯度分析方法開發時，選擇降低起始有機相的比例，甚至以純水相作為起始流動相來增大該類化合物的容量因子。但化合物色譜峰峰形會出現峰展寬以及嚴重的C18色譜柱固定相孔內去濕現象（Dewetting）；在停泵并重新恢復流速后，會出現化合物保留時間減少，色譜峰峰形異常（峰分叉、峰拖尾）等方法重現性問題，尤其以拖尾zui為常見。

對于這些極性化合物該如何得到較好的保留，在這里且聽小編慢慢道來。

一 孔內去濕現象（Dewetting）

反相HPLC一般以水作為弱洗脫相，以甲醇、乙腈等有機試劑作為強洗脫相。在運行梯度時，有機相的比例一般可在5%-100%范圍內變化，以適應不同樣品的分離需求。對于極性化合物來說，在典型的C18色譜柱上，即使有機相比例為5%亦不能夠做到有效保留。在進一步降低有機相比例（以至為零），就會引起色譜柱多孔內表面以及固定鍵合相的去濕現象（Dewetting）。

如圖1A所示，5%及其以上有機相時，流動相可輕易浸入固定相基質多孔內，浸濕內表面以及C18烷烴鏈，且C18鏈呈自由伸展構象，可很好的與樣品組分的疏水部分發生相互作用實現適當的保留。當使用100%水相的時候，如圖1B，雖然可以選擇增da色譜柱前段壓力的方式，使得純水相浸入基質多孔內部，卻無法實現對內表面以及C18鏈的有效浸濕，此外由于色譜柱沿流動相流動方向上的壓力降現象（如圖2），使得整個色譜柱的浸濕狀態存在很大差異。當柱前壓減小時（如停泵），由于多孔內部的強疏水性，純水相則被“排出”孔隙，導致去濕現象發生，如圖1C所示

C18鏈在孔內去濕現象發生前后，在多孔內的構象如下圖3所示。在典型反相HPLC流動相下（水相≤95%），C18鏈在多孔內呈現自由伸展構象；在100%水相下， C18鏈則相互之間“交聯”并zui大程度的靠近內表面，形成疏水屏蔽層，失去與待分離組分疏水部分相互作用的能力，導致保留時間變短。

二 極性化合物分離挑戰

以典型的反相C18色譜柱對極性化合物進行分離時，往往會出現保留時間過短，色譜峰峰形拖尾問題。保留時間過短往往是由于化合物本身或者在體系中解離之后極性過大，油-水分配系數過小而不能與疏水選擇性基團發生足夠的疏水相互作用，進而隨起始流動相一起直接流出色譜柱。

如有機酸類化合物在流動相pH大于其pKa時發生解離而本身帶負電，可與硅膠基質上殘留的金屬離子發生靜電相互作用；有機堿類化合物在流動相pH小于其pKa時發生解離而本身帶正電，與弱酸性的硅羥基產生靜電相互作用；多羥基，羥基-胺類有機化合物以及未解離有機酸堿類化合物與硅羥基之間的氫鍵相互作用。以上三種“二級保留”相互作用，均會造成有機極性化合物的拖尾。此外，溶解極性化合物的溶劑選擇不合適的話，也會導致色譜峰拖尾現象。典型極性化合物如下圖4所示。

因此，極性化合物在反相色譜柱上做分析方法開發時主要面臨以下幾方面的問題：

（1）如何使得極性化合物具有適當的保留時間；

（2）如何避免在使用高水比例甚至純水相洗脫時出現的孔內去濕（相塌陷）問題；

（3）如何zui大可能地減小色譜峰拖尾因子，獲得優異的峰形；

三 極性化合物分離策略

利用純水相洗脫方式對極性化合物進行分離，面臨色譜柱固定相孔內去濕（相塌陷）問題，但可通過對經典反相C18鍵合相進行改性，或者使用其他鍵合相以及使用Hilic分離模式，zui大程度地減小或避免該現象的發生，同時做到對極性化合物有效保留。

色譜柱孔內去濕現象的發生以及程度的大小與色譜填料顆粒孔徑的大小，多孔內表面鍵合相的鍵合密度，所用烷烴鏈長度、基質表面裸露的硅羥基數量以及封端類型有關。

3.1 非封端短鏈烷烴鍵合固定相

這種類型的反相色譜柱主要特點有兩個：硅膠基質表面裸露的硅羥基不封端以及鍵合固定相鏈長度小于C8。由于固定相烷烴鏈長度遠小于C18，多孔內疏水性變小，加之表面硅羥基不封端使得純水相與多孔接觸角變小，與典型C18相比，發生孔內去濕現象的可能性大大減小。與此同時，該種類型的色譜柱由于鍵合烷烴鏈長度較小，在對樣品組分分離的時候，吸附作用以及硅羥基氫鍵相互作用占主要地位。例如月旭Ultimate®XB-C1。

3.2 極性封端與極性增強型固定相

該型色譜柱采用極性或者親水性的封端試劑對表面裸露的硅羥基進行封端，C18的鍵合密度較低，這種改性方式與典型的C18色譜柱相比，增大了內表面的水浸潤性且較低的鍵合密度也使得孔內疏水性相對減小，因而允許使用100%水相。例如月旭Ultimate®ALK-C18。

3.3 極性內嵌烷基固定相

這種類型的色譜柱在長鏈烷基靠近硅膠內表面的一端，內嵌入甲酸酯基類、脲或者酰胺基以及硫酰胺基等極性改性官能團。由于極性內嵌，使得整個鍵合相的親水性增強，多孔內疏水性減小，在100%水相條件下，極性內嵌烷烴鏈依然保持自由伸展構象。此外，內嵌極性基團對表面裸露的硅羥基亦有一定的屏蔽作用，減小了極性化合物特別是堿性化合物的拖尾因子，色譜峰峰形更加對稱。例如月旭Ultimate®Polar-RP。

四 常用耐100%水相色譜柱

月旭常用的耐100%水相的反相色譜柱有：

典型反相HPLC色譜柱在使用100%水相對極性化合物進行分離分析時，易出現硅膠多孔內去濕（相塌陷）現象，導致化合物保留時間減小，方法重現性出現問題。通過對色譜柱硅膠表面或者烷烴鏈改性，如增加內表面極性大小以及烷烴鏈內嵌極性官能團，使得多孔內表面及固定相被水浸潤能力增加，而減少或避免孔內去濕現象的發生。此外，也可通過調整HPLC操作方式以及改變色譜條件，對極性化合物的保留因子以及峰形進行調整。