Ni Tanrose 6FF（NTA）親和介質(zhì)是將金屬離子Ni2+螯合在以氨三乙酸（NTA）為配基的瓊脂糖凝膠上形成的親和層析介質(zhì)，較 IDA 結(jié)合Ni2+牢固一些。具有吸附量大、選擇好、易于再生、成本低等特點，廣泛用于生物制藥和生物工程下游蛋白質(zhì)和多肽的分離純化，尤其是組氨酸標(biāo)簽蛋白質(zhì)的高效純化。
Ni Tanrose 6FF（IDA）親和介質(zhì)是將金屬離子Ni2+螯合在以亞氨基二乙酸（IDA）為配基的瓊脂糖凝膠上形成的親和層析介質(zhì)，是一種非常悠久的Ni2+親和填料，由于Ni2+與配基鰲合鍵較少，容易受到小分子的攻擊而使Ni2+容易脫落，但其載量也相對較高。
以下是使用NTA/IDA填料可能會出現(xiàn)的問題及解決方法：
01 通過His標(biāo)簽純化的蛋白，雜質(zhì)比較多應(yīng)當(dāng)怎么做？
①可能原因：蛋白酶會降解部分目的蛋白。
解決方法：加入多種蛋白酶抑制劑改進(jìn)。
②可能原因：雜質(zhì)蛋白與鎳柱親和力強(qiáng)。
解決方法：可提高雜質(zhì)蛋白與鎳柱結(jié)合起始咪唑濃度。
③可能原因：雜蛋白和目的蛋白結(jié)合。
解決方法：可通過超聲前加入去垢劑或者還原劑消除（1%-2% Triton X-100）。
④可能原因：洗滌不充分。
解決方法：增加洗滌的次數(shù)，充分洗滌。
02 標(biāo)簽蛋白不與金屬螯合親和層析柱結(jié)合應(yīng)當(dāng)怎么做？
①可能原因：超聲的功率不對（功率太大會導(dǎo)致蛋白炭化，功率太小會導(dǎo)致蛋白沒有釋放）。
解決方法：改變超聲功率或超聲前嘗試添加溶菌酶增加細(xì)胞破碎率。
②可能原因：組氨酸標(biāo)簽暴露不完Q。
解決方法：在變性條件下（4-8M脲或4-6M鹽酸胍）進(jìn)行純化，此時Ni-6FF（IDA）中鎳離子容易脫落，可選擇耐受變性劑的螯合填料，如月旭科技的親和填料Ni Tanrose 6FF（NTA）。
③可能原因：His標(biāo)簽丟失。
解決方法：WB檢查His-tag是否表達(dá)，上游構(gòu)建，改變His-tag的位置（C-端或N-端），必要時增加標(biāo)簽個數(shù)；孵育的時間不夠，降低流速和增加孵育的時間。
03 用幾次后鎳柱載量下降、掛柱效率低，應(yīng)該怎么做？
可能原因：
逐漸積累沉淀，變性或非特異結(jié)合的蛋白占據(jù)了有效的結(jié)合位點，并且通過洗脫液無法*清洗所致。
解決方法：
較溫和的清洗方式：用2倍柱體積的6M鹽酸胍或8M尿素洗滌，然后用5倍體積的緩沖液洗滌，以去除沉淀或變性物質(zhì)，接著用2倍柱體積的1% Triton X-100洗滌，然后用5倍柱體積的緩沖液洗滌，以去除疏水結(jié)合的物質(zhì)。若改變不明顯，可選擇強(qiáng)烈清洗方式。
強(qiáng)烈清洗方式：首先用5-10倍柱體積的脫鎳緩沖液（20 mM 磷酸鈉，0.5 M NaCl,，50 mM EDTA，pH 7.4）洗滌，進(jìn)行脫鎳操作，然后用5-10倍柱體積的平衡緩沖液沖洗，最后用5-10倍柱體積的雙蒸水沖洗；隨后進(jìn)行清洗操作，去除離子型雜蛋白，可以用5倍柱體積的1.5M NaCl溶液，然后10倍柱體積的雙蒸水沖洗；去除沉淀或變性蛋白，可以用1M氫氧化鈉溶液，結(jié)合1-2小時，然后用10倍柱體積的平衡緩沖液和10倍柱體積的雙蒸水迚行沖洗；去除疏水蛋白或者脂蛋白，可以用5-10倍柱體積的30%異丙醇溶液清洗，然后10倍柱體積的雙蒸水洗滌；最后進(jìn)行生鎳操作，用0.1M硫酸鎳上柱，隨后5倍柱體積的雙蒸水和平衡緩沖液迚行洗滌。如需保存，保存在20%乙醇溶液。
04 簽蛋白結(jié)合在填料上洗脫不下來，應(yīng)該怎么做？
①可能原因：洗脫條件太溫和（標(biāo)簽蛋白仍然結(jié)合在柱上，結(jié)合力較強(qiáng)）。
解決方法：增加咪唑的梯度洗脫或降低pH 來找出最佳的洗脫條件。
②可能原因：降低pH的方法洗脫，若pH低于3.5，會導(dǎo)致鎳離子脫落。
解決方法：改變洗脫辦法，如咪唑競爭性洗脫。
③可能原因：蛋白已沉淀在柱上。
解決方法：1.減少上樣量，或使用咪唑的線性梯度而不是分步洗脫以降低蛋白的濃度。試用去污劑或改變NaCl的濃度，或在變性條件（去折疊）下洗脫（用4-8 M脲，或4-6 M鹽酸胍）；2.蛋白在柱上變性固化，用0.5M氫氧化鈉洗柱。
④可能原因：非特異性疏水或其他相互作用。
解決方法：加非離子去污劑到洗脫緩沖液（如：2% Triton X-100）或增加NaCl的濃度。
⑤可能原因：在填料表面形成高密度融合蛋白的聚集。
解決方法：選擇合適載量的填料，切勿一味追求高載量。
05 柱使用過程中發(fā)現(xiàn)堵塞嚴(yán)重，且流速越來越慢應(yīng)該怎么做？
可能原因：
樣品中細(xì)胞碎片或其他雜顆粒所致。
解決方法：
樣品處理過程中，高速離心，推薦用0.45um的濾膜過濾。如果柱子堵塞嚴(yán)重，重生時使用1% Triton X-100/PBS浸泡過夜。流速慢，可在柱子下面接一根軟管。
06 鎳柱使用過程中出現(xiàn)棕色應(yīng)該怎么做？
可能原因：
緩沖液中DTT的影響，DTT會對鎳柱的顏色和純化效率有很大的影響，在堿性的緩沖液條件下，鎳離子會被DTT還原生成棕色的沉淀，所以要盡量避免DTT的參與。
解決方法：
若樣品中含有DTT，在上樣之前, 我們推薦采用不含還原性試劑的空白運(yùn)行來除去任何較弱結(jié)合的鎳離子。
空白運(yùn)行方法（使用不含還原劑的平衡液和洗脫液）：
1）5倍柱體積的雙蒸水洗柱；
2）5倍柱體積的平衡液洗柱；
3）5倍柱體積的洗脫液洗柱；
4）10倍柱體積的平衡液平衡。
當(dāng)不使用時，勿將Ni Tanrose 6FF（IDA）保存于含還原性試劑的緩沖液中。
