如何 選擇緩沖液

隨著蛋白質化學和分子生物學的發展，用于各種疾病治療的蛋白質類藥物的研制和應用已成為生物醫藥產業發展的熱點。多肽和蛋白類藥物副作用小、活性強，并具有標本兼治的功效。當我們純化蛋白時，最重要的就是要保持蛋白在純化過程中不能失活，或者是盡量降低純化過程對蛋白活性帶來的損失。因此，在設計緩沖液時應考慮以下幾個因素：pH值、緩沖體系、鹽離子、還原劑和穩定劑。

PH值

很多實驗的pH值設定在7.4以模仿生物條件，但如果目的蛋白在此條件下不穩定，就需要改變PH值使它在溶液中處于可溶且不會降解的狀態。當溶液PH值在蛋白等電點pI附近時，其在溶液中會表現得不易溶解，因為此時蛋白表面沒有凈電荷，從而容易聚集。可以用ExPASy網站的ProtParam工具快速簡便地計算蛋白等電點pI值，只要提交蛋白序列即可。

緩沖體系

首先我們要確保所選擇的緩沖體系在設定的pH值上確實具有緩沖能力，其解離常數pKa值應該在所設定的pH值上下一個單位內。

再者是確保緩沖液濃度足夠高以達到實際緩沖溶液的作用。一般會選擇的濃度是20~100mM。需要注意的是所使用的緩沖體系不能影響蛋白活性，比如磷酸鹽會抑制激酶的活性，所以反應前應*地透析掉。

此外，一些緩沖體系對溫度非常敏感，例如Tris-HCl緩沖液，如果在25℃時將緩沖體系調至pH值8，其pH值將在5℃時增加到8.58，在37℃時降到7.71，所以，如果不是在25℃下進行實驗，就應該考慮到這個pH值可能在實驗條件中不適用。

鹽離子

許多緩沖液中含有NaCl，以幫助保持蛋白的可溶性和模擬生理條件，濃度一般為150mM，但在不同的蛋白純化步驟中，可能需要不同的鹽離子濃度。離子交換層析一般是低鹽結合、高鹽洗脫，結合時需要降低鹽濃度是為了避免高離子強度下，鹽離子與蛋白競爭與填料結合，防止蛋白從離子交換柱中流穿，從而使柱子能夠結合目的蛋白；而疏水層析一般為高鹽結合、低鹽洗脫。

還原劑

如果目標蛋白含有半胱氨酸殘基，可能會出現殘基間的氧化問題，并可能導致蛋白聚集。為了防止這一點，往往會在緩沖液中添加一些還原劑，如DTT、TCEP和巰基乙醇。

TCEP是這三個還原劑中zui穩定的，但也是最貴的。通常純化過程中的緩沖液里會添加DTT，在最后保存酶液的緩沖液里添加TCEP。還原劑濃度一般是5~10mM，它應遠遠高于蛋白濃度。DTT和巰基乙醇在室溫下就會降解，所以需要將添加了還原劑的緩沖液處于低溫保藏，或者在使用時再添加還原劑。

使用還原劑時要確保柱材料能夠與之相容，比如高濃度的還原劑會脫掉鎳柱中的鎳，并使柱子顏色變深呈棕色，雖然鎳柱能進行再生，但柱載量將會受到很大影響。

穩定劑

添加一些穩定劑到緩沖液中，能幫助提高蛋白純化時的蛋白溶解度和穩定性。在緩沖液中添加惰性蛋白BSA在某種程度上可以穩定目標蛋白，但必須確保這些加入的穩定劑不干擾實驗；有時添加甘油、聚乙二醇等以增加緩沖液粘度，有助于防止蛋白聚集；另外，使用少量的表面活性劑和一些離子化合物如硫酸鹽、氨基酸、檸檬酸等可以避免蛋白間的離子相互作用，幫助蛋白溶解。

以上就是在設計緩沖液時應該考慮的五個因素，為了保持蛋白在純化過程中的活性和穩定性，我們應當設定最佳實驗方案。