蛋白質(zhì)純化注意事項(xiàng)

在蛋白質(zhì)純化過(guò)程中，需注意幾個(gè)問(wèn)題。首先，提純過(guò)程中始終要控制pH值，盡量避免由于過(guò)酸或過(guò)堿而引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的不可逆變化。緩沖液要有合適的pH值，又要對(duì)蛋白質(zhì)無(wú)害，在提純植物和菌類中的蛋白質(zhì)時(shí)，通常需要較大的緩沖容量，此時(shí)要注意緩沖液的濃度，同時(shí)還要注意緩沖液組分是否合適，會(huì)不會(huì)產(chǎn)生副反應(yīng)等。含巰基的蛋白質(zhì)（其中的巰基未結(jié)合成二硫鍵時(shí)）特別容易被氧化，因此，要維持一個(gè)還原環(huán)境。可加入一些含有巰基的還原劑，并使整個(gè)體系保持無(wú)氧狀態(tài)，以解決此問(wèn)題，但在有些情況下，加入的巰基化合物可能會(huì)抑制蛋白質(zhì)的活力。

提純過(guò)程中，通常要保持低溫，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)有蛋白水解酶存在，這種酶在組織勻化后處于活化狀態(tài)，能降解蛋白質(zhì)。因此，必須保持低溫來(lái)降低水解酶的作用。但要注意，有時(shí)低溫又能使某些酶的四級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞。一般情況下，蛋白質(zhì)在0℃時(shí)比較穩(wěn)定，但丙酮素羧化酶對(duì)冷敏感，25℃時(shí)穩(wěn)定。有些酶則需在-20℃或-70℃下穩(wěn)定活性。

此外，還有一些常用的辦法可有效地減少蛋白質(zhì)變性，如有些二價(jià)離子（Mg²⁺、Ca²⁺等）的存在有助于蛋白質(zhì)或蛋白絡(luò)合物的穩(wěn)定；提純酶時(shí)，可以加入專一性的底物；有時(shí)候需要使用絡(luò)合劑（如乙二胺四乙酸鹽）除去不需要的離子，特別是那些由水源帶來(lái)的有害金屬離子。這些方法可視不同情況加以利用。

要注意的另一個(gè)因素是，在提純過(guò)程中即使很小心，蛋白質(zhì)也會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)上的變化。因此，提純后的蛋白質(zhì)，即使其活力基本上得以保留，它的構(gòu)象也可能不同于天然構(gòu)象或完整功能的構(gòu)象。在這種情況下，在生物體外測(cè)得的蛋白質(zhì)的性質(zhì)未必能準(zhǔn)確地反映這些大分子在活體內(nèi)的性狀。

含多個(gè)亞單位蛋白質(zhì)的解離是一種特殊類型的變性。提純蛋白質(zhì)時(shí)，當(dāng)所測(cè)得的活力是僅由一種亞單位表現(xiàn)出來(lái)的時(shí)候，其他的亞單位可能會(huì)因?yàn)樽⒁獠坏蕉鴣G失。有的蛋白質(zhì)在體內(nèi)具有多功能形式，其生物活性是由兩個(gè)以上不同的遺傳基因決定的蛋白質(zhì)一起顯示出來(lái)的。那么由一個(gè)已經(jīng)純化的蛋白質(zhì)的性質(zhì)去推斷它在體內(nèi)完整的生物學(xué)功能時(shí)要特別小心。這時(shí)分析提純過(guò)程中總的活力是有益的。在提純的早期階段，如果用總活力作基準(zhǔn)，在提純結(jié)束時(shí)希望能回收50%總活力，而實(shí)際所能達(dá)到的收率往往只有5%-20%。在有些情況下，特別是有大量原料可供利用的情況下，我們可專心致力于獲得高比活的樣品，而不必顧忌收率。