蛋白純化四大層析原理

基本原理：凝膠層析亦稱凝膠過濾、排阻色譜或分子篩層析等。其機(jī)理是分子篩效應(yīng)，主要根據(jù)蛋白質(zhì)分子的大小進(jìn)行分離和純化。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，多是交聯(lián)的聚糖（如葡聚糖或瓊脂糖）類物質(zhì)。單個凝膠珠本身象“篩子"。不同類型凝膠的篩孔的大小不同。分子量大的物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部，隨洗脫液從凝膠粒子之間的空隙擠落下來，所以大分子物質(zhì)遷移速度快；小分子物質(zhì)要通過凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部，所以小分子物質(zhì)遷移速度慢。一般來說，凝膠過濾層析柱越細(xì)、越長純化的效果越好。

基本原理：據(jù)負(fù)載電荷的不同分離蛋白質(zhì)，分辨率高且對樣品的容納能力強(qiáng)。分離原理是基于帶電蛋白質(zhì)和帶相反電荷的色譜介質(zhì)之間的可逆相互作用。蛋白質(zhì)結(jié)合到柱子上，然后改變條件，使結(jié)合物逐步被洗脫。

這種洗脫通常是通過增加鹽濃度或pH值的變化來進(jìn)行，采用逐步調(diào)整或連續(xù)梯度進(jìn)行洗脫。最常見的，使用鹽（氯化鈉）溶液進(jìn)行梯度洗脫，通過結(jié)合過程濃縮靶蛋白，并且以純化、濃縮的形式收集。

基本原理：根據(jù)蛋白質(zhì)疏水性的差異分離蛋白質(zhì)。分離的依據(jù)是蛋白質(zhì)與層析介質(zhì)的疏水表面之間可逆的相互作用。這種作用在高離子強(qiáng)度緩沖液中增強(qiáng)，從而疏水性相互作用層析成為硫酸銨沉淀或離子交換層析過程高鹽溶液洗脫后理想的“下一步"。樣品在高離子強(qiáng)度溶液（如1.5M硫酸銨）中結(jié)合到柱子上。然后改變條件，使結(jié)合的物質(zhì)逐漸洗脫下來。

洗脫通常是通過降低鹽濃度。鹽濃度要逐步調(diào)整或有一個持續(xù)減少的梯度。最常見的是通過硫酸銨鹽濃度遞減的梯度來洗脫樣品。在結(jié)合過程中靶蛋白被集中，并以純化和濃縮的形式被收集。其他洗脫程序包括降低洗脫液極性，使用促溶劑（尿素、鹽酸胍）或使用去污劑，改變pH值或溫度。

基本原理：據(jù)特異性生物識別，即一種蛋白（或一組蛋白質(zhì)）和色譜基質(zhì)上一種特定的配體間可逆的相互作用。這項(xiàng)技術(shù)是捕獲或中度純化步驟理想的選擇，只要靶蛋白有合適的配體就可以使用該技術(shù)。