淺談尺寸排阻色譜法方法開發(fā)影響因素

尺寸排阻色譜法（SEC）是根據(jù)溶液中分子的大小分離化合物的，在柱子的填料中較大的分子會被較細的小孔排除在外。當以有機溶劑作為流動相，使用合成聚合物填料時，SEC就涉及凝膠滲透色譜（GPC）。在以水緩沖液為流動相和使用親水性柱填料分離生物聚合物(例如蛋白質)時，SEC就稱為凝膠過濾色譜。凝膠過濾色譜可作為用以分離生物活性物質（通常等同于在多個純化步驟中其他的色譜技術）的前處理工具，或者亦可作為獲取溶質分子信息的工具，包括分子大小或形狀、聚集狀態(tài)、生物聚合物與其配體結合的動力學參數(shù)。

過去凝膠過濾色譜一般采用葡聚糖、瓊脂糖或者聚丙烯酰胺等軟凝膠作為填料。對于可壓縮的填料，必須根據(jù)流動相的流速選用適合的重力或者低壓泵。軟凝膠可以通過交聯(lián)作用提高穩(wěn)定性，這樣就可以承受更高的流速和幾兆帕的壓強。凝膠過濾色譜分析時常用的剛性載體是：以親水性固定相修飾的硅膠基質或者交聯(lián)的有機聚合物。這些物質能在HPLC系統(tǒng)中使用，其機械強度可以承受幾十兆帕或更高的壓強。

尺寸排阻色譜法（SEC），顧名思義，它的基本原理就是當目標分析物進入凝膠滲透色譜柱，大體積的分子由于比凝膠顆粒的孔隙大不能進入孔隙，只能在凝膠顆粒之間的空隙流過，最先被淋洗出來；中等體積的分子部分可以進入凝膠顆粒的孔隙，并經顆粒間的空隙流過，淋洗出來的順序在大體積分子和小分子之間；體積較小的分子比凝膠顆粒的孔隙小，可以進入凝膠顆粒的空隙，并在凝膠顆粒的孔隙以及顆粒之間的空隙不斷進入出來擴散，速度最慢，所以是最后被淋洗出來的。當確定儀器型號和實驗所需條件后，化合物的淋出體積就與其分子量有關，分子量越大，其淋洗體積越小，具體分離原理如圖。

Xtimate^® SEC色譜柱是月旭推出的硅膠基質的體積排阻系列色譜柱，其色譜填料為高純度、具有良好穩(wěn)定性的硅膠微球表面鍵合親水性聚合物。月旭科技采用特殊的表面修飾技術，確保了該填料具有良好的穩(wěn)定性和批次重現(xiàn)性。

尺寸排阻色譜是根據(jù)溶液中分子量大小分離的，其保留時間取決于溶質分子進出固定相孔結構的相對滲透度。然而這個是在理想狀態(tài)下的分離情況，色譜柱內還存在其他次級作用力，對目標物的分離產生影響。

因此，以Xtimate^® SEC色譜柱做方法開發(fā)時，需要注意以下幾點因素：

可根據(jù)目標物的分子量，來選擇合適孔徑的色譜柱。

為避免色譜柱堵塞，所有樣品和溶劑，包括緩沖鹽，都必須在使用前用0.45μm或0.22μm濾膜過濾。Xtimate^® SEC可以使用水或有機溶劑與水的混合物，與大多數(shù)緩沖鹽溶液也兼容。流動相使用前需脫氣，否則可能出現(xiàn)柱壓和基線波動較大。這時可用較大流速沖洗色譜柱2-5min，如對于7.8mm*300mm的色譜柱，可用1.25mL/min的流速。

色譜柱中不可避免會存在其他次級作用力，為了最大限度降低填料與被測物的次級作用力，必須調整流動相的離子強度。NaCl是SEC分離中比較常用的鹽，可通過調整離子強度，減少次級作用力，進而改善峰形和分離效果。

流動相的pH調整，更多也是為了減少色譜柱中的次級作用對被測物的影響，所以測定過程中需選擇合適的pH。為獲得最佳分離效果和延長使用壽命，建議使用pH在2-7.5范圍內的流動相。

盡管Xtimate^® SEC可在高至3000psi 的壓力下使用，但正常的操作壓力應當?shù)陀?500psi。長時間在高壓下運行會損壞色譜柱和輸液泵。由于壓力來源于流速，因此最大流速將受制于系統(tǒng)所能承受的壓力。一般而言，柱壓會隨著色譜柱使用時間的增加而逐漸增加。 

盡量采用低流速測試，可以提高分離度，進而獲得更好的測試效果。內徑為4.6mm和7.8mm的色譜柱，一般建議其正常操作流速分別為0.1-0.4mL/min和0.1-1.25mL/min。

通過增加色譜柱的長度可以改善SEC分離度，所以在分離過程中，在一根色譜柱達不到分離效果時，可以考慮兩根色譜柱串聯(lián)，甚至不同孔徑的色譜柱串聯(lián)（注：一般大孔徑的在前，小孔徑的在后）。這種條件下通常也會造成出峰時間延后，及系統(tǒng)壓力增加。

最高操作溫度為80℃。為了獲得最長的使用時間，最佳操作溫度為10-30℃。長時間在高溫（>80℃）下操作也會損壞色譜柱，這種情形在高的 pH（>7.5）條件下尤其突出。

隨著使用次數(shù)的增加，某些樣品可能吸附到入口篩板或填料上。當積累到一定程度時會出現(xiàn)壓力升高，并伴隨峰形異常等現(xiàn)象。因此，日常使用過程中需要經常注意對色譜柱進行沖洗和維護，以達到最佳的分離效果和延長使用壽命。