液相色譜，你問(wèn)我答（十四）

什么是液相系統(tǒng)的梯度滯留體積？

它對(duì)分析有什么影響？

答：梯度滯留體積是梯度混合點(diǎn)到柱子進(jìn)口之間的體積。這個(gè)體積導(dǎo)致梯度有一定延遲，因而也叫做梯度延遲體積。

現(xiàn)在很多液相系統(tǒng)都是單泵低壓梯度系統(tǒng)，就是說(shuō)梯度是在泵的上游混合 的。梯度延遲體積的第一個(gè)部分是梯度混合器的體積。這樣，你就要加上梯度混 合器和泵頭之間的連接體積。第二個(gè)是泵頭的體積，然后是進(jìn)樣器的連接管路。通常，這個(gè)體積增大一點(diǎn)來(lái)充分混勻流動(dòng)相而使梯度平滑一點(diǎn)。進(jìn)樣器到進(jìn)樣器 和柱頭之間的體積是另一個(gè)部分。看看在通常的低壓梯度系統(tǒng)中，梯度滯留的地 方相當(dāng)多…

也可以再高壓一邊產(chǎn)生梯度。這最少需要2個(gè)泵，可以盡量減少梯度延遲體積。但是高壓梯度系統(tǒng)不是這樣設(shè)置的。通常，連接位置在進(jìn)樣器之前。好處是樣品不管怎么樣都能進(jìn)入柱子，而不用依賴哪個(gè)泵的流速。最好是用初始流動(dòng)相來(lái)溶解樣品，這樣梯度延遲體積可以*不記了。這個(gè)技術(shù)的一個(gè)小缺點(diǎn)就是樣品會(huì)被流動(dòng)相的第二個(gè)組分稀釋一點(diǎn)點(diǎn)，但是如果初始流動(dòng)相是90%的流動(dòng)相A的話這個(gè)問(wèn)題就很小了，只稀釋了10%。另一個(gè)問(wèn)題是通常大部分峰會(huì)聚集在柱頭，這樣在開始的等度洗脫中只有一小部分峰被洗脫下來(lái)。這時(shí)，我們要確保進(jìn)樣器與柱頭之間的體積要足夠小。高壓梯度系統(tǒng)就沒(méi)有這種問(wèn)題。

下面我們來(lái)討論一下梯度延遲體積怎樣影響分析！由于梯度到達(dá)柱子需要時(shí)間，因此梯度一開始就延遲了，開始這段時(shí)間就是跑等度。第一個(gè)影響就是前面 的峰換個(gè)系統(tǒng)后保留時(shí)間可能就不一樣了。如果梯度延遲時(shí)間比較明顯，那么色譜圖中前期的峰就會(huì)明顯不同，而梯度后期則與延遲體積不怎么相關(guān)。但是洗脫時(shí)間還是會(huì)隨梯度延遲時(shí)間改變。這些情況都很讓人頭疼。這就是為什么在QC實(shí)驗(yàn)室中避免使用梯度的原因。畢竟樣品時(shí)通過(guò)保留時(shí)間來(lái)定性的，如果換儀器后保留時(shí)間不一樣，那么就不好判斷了。當(dāng)然也可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間來(lái)判斷，但是還是不叫復(fù)雜….

我同意，那確實(shí)有點(diǎn)復(fù)雜，但也不是

無(wú)法克服的。還有其他要考慮的嗎？

答：如果在低壓系統(tǒng)中混合體積較大，那么你觀察到的梯度圖譜不會(huì)很尖銳。這通常不會(huì)影響標(biāo)準(zhǔn)線性梯度，但是如果是階梯狀的梯度就會(huì)影響洗脫了。通常用延遲體積小的梯度系統(tǒng)，現(xiàn)在很多HPLC系統(tǒng)的梯度延遲都很小。對(duì)于循環(huán)時(shí)間小的非常快速的梯度，即使延遲體積再小也不夠。這時(shí)可以采 用延遲進(jìn)樣技術(shù)。理論上，梯度還是按通常的運(yùn)行，但是直到梯度到達(dá)進(jìn)樣器時(shí)才進(jìn)樣。這樣就想沒(méi)有梯度延遲體積一樣。當(dāng)然進(jìn)樣環(huán)以及進(jìn)樣器到柱頭的管路的體積還是有一定的延遲，但是小的可以忽略了。

當(dāng)梯度運(yùn)行完后，柱子會(huì)重新開始平衡，也是有延遲。所以我們不用等到柱子重新平衡好后再開始新的梯度，我們只要知道設(shè)計(jì)的程序，泵的運(yùn)行與柱頭實(shí)際發(fā)生的不一樣就行了。梯度運(yùn)行和柱子再平衡被排空梯度延遲體積抵消了。這個(gè)解決方法讓我們可以在單泵系統(tǒng)中實(shí)施沒(méi)有延遲的快速梯度。另外，如果在不同的儀器上運(yùn)行同樣的梯度，延遲體積造成的影響會(huì)很小。這樣我們就可以在不同的儀器上重復(fù)梯度。當(dāng)然，以上都是假設(shè)梯度發(fā)生器穩(wěn)定工作，可重復(fù)并且能確實(shí)按要求工作。

怎么測(cè)量梯度延遲體積呢？

怎么確定系統(tǒng)的梯度確實(shí)是想要的呢？

答：有個(gè)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試非常有用，參考《JJG 705 2014液相色譜儀檢定規(guī)程》中對(duì)梯度檢定的部分。不接柱子，在流動(dòng)相B中加少量的UV吸收劑0.1%丙酮，然后運(yùn)行梯度。這可以觀察真實(shí)的梯度。從程序與實(shí)際的差別中可以檢測(cè)到系統(tǒng)的梯度延遲體積。如果你采用延遲進(jìn)樣，你就必須要了解這點(diǎn)。對(duì)系統(tǒng)了解的越多，在梯度分析中浪費(fèi)的時(shí)間就會(huì)越小。